水稻鉀、銨雙功能轉運分子及應用的制作方法

文檔序號:350959
專利名稱:水稻鉀、銨雙功能轉運分子及應用的制作方法
技術領域
本發明涉及植物基因工程領域,具體地,本發明涉及水稻鉀、銨雙功能轉運分子及 應用。
背景技術
N、P、K是作物生長的必要的大量元素,營養的吸收和利用是限制產量的主要因素,提高作物營養的有效利用一直是育種追求的目標,在當前富營養化土壤污染日益加劇的條 件下,增加作物營養的自身利用效率,造就綠色生態農業,也是值得關注的另一個方面。土 壤中的鉀、氮是植物鉀營養的主要來源,且土壤中的鉀、氮易淋溶流失,過多地淋溶流失,會 造成土壤含營養量有限,使有效營養成分利用越來越困難,另一個方面過多施用也會造成 水體的富營養化和水環境的嚴重破壞。鉀、氮是植物細胞內最重要的元素,也是影響作物產 量的三大營養要素之一。鉀是維持細胞內、外電化學勢的主要溶質,影響著植物細胞的水 勢、滲透勢和膨壓,參與細胞的運動、生長、伸長;幫助光合電子傳遞,提高植物對其他營養 元素的吸收和利用;鉀也是酶的輔助因子,使細胞質保持著適宜的PH值,直接或間接地影 響著50多種酶的活性;鉀的另一重要生理作用是增強細胞對環境條件的調節作用,從而增 強植物對各種不良逆境的耐受能力,如干旱、低溫、含鹽量、病蟲危害、倒伏等;氮是細胞 的結構組分,也是蛋白質的重要組成成分,其重要性不言而喻。鉀以離子的形式存在,不是細胞的結構組分,可從一個部位轉移到另一個部位在 植物體內重復利用;氮大部分也是以離子的形式(NH4+、NO3-等)被吸收,與其易流動、再分 配的特點相適應,植物體內存在一大類與鉀、氮轉運有關的蛋白分子,從離子的親和性、選 擇性及驅動的能量來源分為不同類型。大量的研究表明,營養的有效利用(包括鉀、銨的吸 收、運輸、分泌等),都是由不同類型的離子轉運體的功能決定,無論是吸收、分配、再循環還 是體內的有效儲存,其效應都是由轉運體的表達和活性調節得以實現。因此,分離、鑒別水 稻鉀、銨轉運體分子,是從分子水平改善水稻氮、鉀營養利用不可逾越的環節,也是轉基因 操作改善其品質的基礎。植物中已鑒定出三個由α-亞基形成的鉀選擇通道家族,分別為Shaker-type、 TPK和Kir-Like,參與鉀吸收、再分配和區域化,維持和產生膜的極性,也發現了以AMTl為 代表的銨轉運體家族。水稻是一年生禾本科植物,世界上近一半人口以稻米為食。水稻缺鉀癥狀表現為 老葉葉尖及前端葉緣褐變或焦枯,同時出現褐色斑點;植株伸長受抑制而萎縮;葉色加深, 呈暗綠色且無光澤;根系細弱,多褐根,老化早衰;抽穗不整齊,秕谷率增加,正常受精的谷 粒也不飽滿,產量和品質下降,氮缺乏會帶來更嚴重的病理癥狀。除了合理施肥,提高田間 管理措施等防治措施外,從水稻本身的鉀、氮營養分子基礎研究入手,增加作物吸收營養和 體內循環利用的效率,無疑可以為應對作物營養缺陷的挑戰,提供值得期待的技術和優質 基因資源。從水稻基因組的數據分析,水稻存在已知的所有類型的植物鉀離子轉運體,至少有11個編碼Shaker家族的鉀通道的基因,分布在不同的染色體上,其中一號染色體有3個,2號有2個,4號有2個,5、6、7、9號各有1個。水稻的Shaker鉀通道目前只有兩個結 果=OsKATl能增加水稻胞內鉀的含量,抵御鹽的脅迫(Obaa et al. ,2007) ;OsAKTl是電壓 依賴的內向整流鉀離子通道,但是對鹽脅迫敏感(Fuchs et al.,2005)。水稻銨離子轉運體 的研究更是滯后于鉀轉運家族的研究,最近的研究表明鉀、銨的轉運既可互相影響、也可協 同運輸;增加外界鉀的含量,可抑制銨的內流,銨、鉀可能部分共享同一條通路,因此有必要 從水稻中克隆能夠提高鉀、銨利用效率的相關基因并驗證其功能,從而篩選出可以利用的 基因資源,并進一步通過轉基因等技術應用于農作物來提高其對鉀、銨的有效利用能力。

發明內容
本發明的發明人為了解決上述問題提出并完成了本發明。本發明的目的是提供一種水稻鉀、銨雙功能轉運分子。本發明的再一目的是提供上述水稻鉀、銨雙功能轉運分子的應用。根據本發明的水稻鉀、銨雙功能轉運分子,其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。根據本發明的水稻鉀、銨雙功能轉運分子基因編碼上述轉運分子,其序列如SEQID No. 1所示。本發明還提供了包含上述水稻鉀、銨雙功能轉運分子基因的真核表達載體,優選 將水稻0sKAT3基因構建到pYES2載體上,得重組質粒pYES2_0sKAT3。本發明提供了所述水稻鉀、銨雙功能轉運分子在同時提高植物N、K營養方面的應 用。從而,本發明也提供了一種同時提高植物N、K營養利用的方法,所述方法包括將所述水 稻鉀、銨雙功能轉運分子基因導入植物中并表達的步驟。本發明首先從粳稻(Oryza sativa ssp. japonica)品種日本晴中克隆了 0sKAT3 基因,驗證了水稻0sKAT3基因具有高效吸收K+的功能,更令人激動的是這一基因還具有 高效轉運NH4+的特性,具體發明如下首先克隆了相關基因,采用缺陷型酵母CY162(Trkl/ Trk2)作為宿主菌,獲得了低鉀條件下生長旺盛的轉化子,由此初步驗證了 0sKAT3的吸鉀 功能;進一步,利用雙電極電壓鉗技術(TEVC)和體外異源表達系統-非洲爪蟾卵母細胞,表 達分析了 0sKAT3離子通道活性、門控特征和離子選擇性,發現0sKAT3不僅可以轉運K+,而 且可以有效地轉運NH4+,精確鑒定了 0sKAT3轉運能力,獲得了比典型Shaker家族基因KATl 吸鉀更強的內向整流鉀通道分子,而且這一基因還有其他同源Shaker家族基因不可比擬 的NH4+特異選擇性,也就是說如果合理的利用這一基因,可同時提高作物對兩種重要的營 養元素(K、N)的利用效率,同時增加吸鉀和吸銨的能力,本發明為有效利用這一基因資源 打下了堅實的基礎。


圖10sKAT3基因的克隆,水稻0sKAT3基因的PCR擴增產物和pEASY_Tl重組質粒的酶切及PCR鑒定,其中, 圖 IA :M 為 Marker III (TransGene) ;Ianel 為 0sKAT3 的 PCR 結果;圖 IB :M 為 Marker III (TransGene) ;Ianel 為 0sKAT3 的 BamHI/Xbal 酶切結果;圖 IC :M 為 Ikb plus marker (TransGene) ;lanel,8,9,10,11,13,14,15,16,17 為菌落PCR檢測結果。圖2水稻0sKAT3基因表達的組織特異性。圖3水稻0sKAT3功能驗證載體的構建,圖 3A 左lanel,2,3,4,5,6 為 pYES2_0sKAT3 質粒 PCR 檢測結果,lane7,8,9,10, 11,12 為 pGEMHE-0sKAT3 質粒 PCR 檢測結果,M 為 Marker III (TransGene);中M 為 Marker III (TransGene) ;Ianel 為 pYES2_0sKAT3 的 BamHI/Xbal 酶切結 果;右M為 Marker III (TransGene) ;Ianel 為 pGEMHE_0sKAT3 的 BamHI/Xbal 酶切結^ ο圖 3B :lanel,2,3,4,5,6,7,9,10,ll,12,15 為 pYES2-0sKAT3 質粒轉化酵母 CY162 后的菌落PCR檢測結果,M為Marker III (TransGene)。圖4、水稻0sKAT3基因互補酵母鉀轉運體缺陷型突變體CY162,從上至下依次為陽性對照,AtKATl轉化子;水稻0sKAT3基因轉化子;陰性對照, PYES2轉化子;從左至右依次為OD6tltl = 1. 0的菌液,10,IO2, IO3, IO4倍稀釋的菌液。圖5 水稻0sKAT3鉀、銨離子雙功能選擇和轉運活性驗證,A 浴液為IOOmM谷氨酸鈉;B IOOmM谷氨酸銨;C IOOmM谷氨酸鉀;D IOOmM氯化 鋰;E =I-V曲線。圖6 水稻0sKAT3鉀離子濃度依賴活性,水稻0sKAT3基因對鉀離子轉運活性的濃度依賴性結果,A :a 浴液為IOmM谷氨酸 鉀;b :50mM谷氨酸鉀;c :100mM谷氨酸鉀;d :I_V曲線;B 尾電流,a 浴液為IOmM谷氨酸 鉀;b :50mM谷氨酸鉀;c =IOOmM谷氨酸鉀;d :I_V曲線。 圖7 水稻0sKAT3銨離子濃度依賴活性,A :a 浴液為IOmM谷氨酸銨;b :50mM谷氨酸銨;c :100mM谷氨酸銨;d J-V曲線; B 尾電流,a 浴液為IOmM谷氨酸銨;b :50mM谷氨酸銨;c :100mM谷氨酸銨;d :I_V曲線。圖 8 :pGEMHE 載體圖。
具體實施例方式實施例1 水稻0sKAT3基因的克隆提取水培生長10天的水稻根和葉的總RNA并以其為模板,以Oligo dT為引物作 逆轉錄,反應完成后取1 μ L逆轉錄產物作為模板,以特異引物K3F和K3R進行PCR擴增。 結果得到約2. Ikb左右的單一產物(圖1Α)。將此擴增條帶純化回收后,與pEASY-Tl載體 連接的重組質粒PTK3,并轉化大腸桿菌感受態細胞DH5ci。挑取單克隆質粒進行酶切檢測 (圖1Β)及菌落PCR鑒定(圖1C)后,選取陽性克隆并測序。K3F 5' -ATGACCCAAGCTCACTCAAAATCTTGCTTCC-3'K3R 5' -CTACATCTCAAGAAGGAATAGATGGTCGCCA-3‘0sKAT3的cDNA序列及其編碼的蛋白質的氨基酸序列如SEQ ID No. 1和SEQID No. 2所示。SEQ ID No. 1 atgacccaag ctcactcaaa atcttgcttc caccagttct gggatggact ccagatcaag
aggagcagcg atagcttcac tgtagagcta ctgccatccc ttggtgcaac tataaaccac 120tccaacaagt tgcagaagtt catcatatcg ccttatgatc cccggtacag atcctgggag 180ctgttcctta tagtcctagt tgtttactct gcctggattt gtccgtttga actagcattc 240ctgagggact taccatctaa gcttttgcta gttgagaaca ttgtggatat attctttgcc 300attgatattg ttttgacgtt cttcgttgct tatgtcgata gcaaaacaca tcttcttgtg 360gatgaccgaa agagaattgc aatgaggtac ctatccactt ggtttatctt tgatgtatgt 420tcaacagcac catttcaacc aatcatcctt ctatttacac acaaggggaa tgacattgct 480ttcaaggtac tcaatttgct caggctgtgg cgtcttcacc gagtcagttc actatttgcc 540aggctggaga aagacatccg attcaactat ttctggacta ggtgctcaaa acttatttct 600gtgaccctct tcgcagtaca ttgtgcagga tgcttcaatt atatgattgc tgacagatat 660cccaacccag agaaaacatg gataggagct gtgatgtcaa ctttcagatc agagagctta 720tggactagat atattactgc tctttactgg tccattacaa cactgacaac aacaggatat 780ggggacctac atgctgaaaa tccaacagag atgctatttg atattgtcta tatgatgttt 840aatctgggct tgacagctta tctcattggc aacatgacca acctagttgt ccatgggacc 900agccgcacca ggaaatttag ggactcaatc caagcagcat cagagtttgc agcacgcaat 960cagctacctg agaacataaa gcagcaagtg ctatctcact tctgcctaca attcaagaca 1020gagggactca accagcaggt catgttagac tgtctaccaa aaggaatccg ctcaagcata 1080gcatacagct tattctttcc gatcatccgg caagcctatc tcttcaatgg agtatctggc 1140aatttcattg cagaactggt catggaagtg caggctgagt acttcccacc aaaggaagat 1200
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B 尾電流測定
權利要求
一種水稻鉀、銨雙功能轉運分子,其特征在于,其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.一種水稻鉀、銨雙功能轉運分子基因,其特征在于,編碼權利要求1所述水稻鉀、銨 雙功能轉運分子。
3.根據權利要求2所述的基因,其特征在于,其序列如SEQID No. 1所示。
4.含權利要求2所述水稻鉀、銨雙功能轉運分子基因的真核表達載體。
5.根據權利要求4所述的表達載體,其特征在于,將水稻OsKAT3構建到pYES2載體,得 重組質粒 pYES2-0sKAT3。
6.權利要求1所述水稻鉀、銨雙功能轉運分子在同時提高植物N、K營養利用方面的應用。
7.一種同時提高植物N、K營養利用的方法,其特征在于,所述方法包括將權利要求2所 述水稻鉀、銨雙功能轉運分子基因導入植物中并表達的步驟。
全文摘要
本發明涉及植物基因工程領域,具體地,本發明涉及水稻鉀、銨雙功能轉運分子及應用。根據本發明的水稻鉀、銨雙功能轉運分子,其基因序列如SEQ ID No.1所示,本發明首先從粳稻(Oryza sativa ssp.japonica)品種日本晴中克隆得到了OsKAT3基因,驗證了該水稻OsKAT3基因具有高效吸收K+的功能,更令人激動的是這一基因還具有高效轉運NH4+的特性。
文檔編號A01H5/00GK101824081SQ20101017814
公開日2010年9月8日 申請日期2010年5月14日 優先權日2010年5月14日
發明者張鵬, 李樂攻, 田麗麗 申請人:首都師范大學
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